細胞處理：

MEF 細胞鋪制：

1. 在 T25 培養瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細胞培養箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養液。一般地，一個 T25 培養瓶中加入 5 ml MEF 完全培養液。

3.  按實驗需要：小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養液的 15 ml 離心管內，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養液 1 ml，重懸后按照一個 T25 培養瓶鋪 1′10^6 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞。

5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將 T25 培養瓶中的 MEF 完全培養液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液待用。

復蘇：

1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉移至 1 個已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養。

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液。

傳代：

1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養箱內消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中。一般地，一個 T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液。放入 37℃培養箱內培養。每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。

凍存液配方：

小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：

1.培養中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養皿或培養瓶（一般地，一個T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。

2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時。

3.  1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中。收取培養液，進行后續實驗。